G蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)是一個跨膜蛋白大家族，參與許多生理和病理過程。細胞外刺激導(dǎo)致細胞反應(yīng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)內(nèi)容物有序和動態(tài)的再分配。細胞反應(yīng)是受體類型特異性的。因此，將gpcr分為Gi/o、Gq/11、Gs和G12/13四個亞類。

      實時無標記的細胞分析提供了亞型特異性的概況，而不需要標記。然而，可用的檢測方法是基于附加拮抗劑或其他反應(yīng)修飾劑的多步驟分析，這在尚未發(fā)現(xiàn)特定途徑的拮抗劑的情況下尤其成問題。

       多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)是一種實時無標記檢測方法，可以檢測傳感器表面的變化，如配體結(jié)合、分子重排和細胞粘附。由于其多參數(shù)方法，可以實時跟蹤多個參數(shù)(圖1)。例如，峰值角位置信號(PAP)檢測GPCR激活期間細胞中發(fā)生的細微質(zhì)量重分布。相反，峰值最小強度(PMI)受SPR耦合角反射回的光量的影響。通過這種方式，不同的MP-SPR反應(yīng)單獨或相互結(jié)合，可以在單步分析中研究不同的GPCR途徑，而無需事先進行細胞處理，使用拮抗劑或途徑調(diào)節(jié)化合物。

圖1：MP-SPR儀器可以連續(xù)測量全SPR曲線，并可以實時跟蹤多個參數(shù)，包括峰值角位置信號(PAP)和峰值最小強度(PMI)。

材料和方法

       將離體細胞懸液移至SPR102-AU傳感器上，將HeLa、CHO-K1或A431細胞固定在SPR102-AU傳感器上。對于HeLa細胞，首先用人纖維連接蛋白包裹傳感器。帶細胞的傳感器在37℃下培養(yǎng)至完全融合。光鏡下觀察細胞融合、形態(tài)學(xué)和單層完整性。

       測量采用MP-SPR Navi?220A NAALI儀器，流速為20-30 μL/min，溫度為37℃。運行緩沖液相當(dāng)于用于細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。樣品注射15分鐘。不含活性化合物的參比樣品被注入第二個通道。實驗結(jié)束后，用臺盼藍處理細胞，在顯微鏡下觀察細胞活力。

結(jié)果和討論

        A431細胞受到緩激肽和腎上腺素的刺激。緩激素與緩激素B2受體結(jié)合，激活Gq通路，而腎上腺素與β2腎上腺素受體結(jié)合，激活Gs通路(圖2)。不同濃度的腎上腺素和緩激素刺激A431細胞導(dǎo)致獨特的時間依賴性PAP譜(圖3)。組胺結(jié)合組胺H1和H3受體，分別激活Gq和Gi通路。這導(dǎo)致了同樣獨特的PAP譜(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖2：腎上腺素刺激β2-腎上腺素受體激活Gs通路，緩激素B2受體激活Gq通路。

圖3：用緩激素或腎上腺素刺激A431細胞可產(chǎn)生獨特的PAP譜。

      除了PAP，其他幾種SPR信號反應(yīng)也表現(xiàn)出一致的和通路依賴的變化。當(dāng)繪制這些信號響應(yīng)與PAP響應(yīng)的對比圖時，尤其是PMI，每個分析的GPCR信號通路都有明確的可區(qū)分模式(圖4)。

圖4：雙參數(shù)PMI-PAP反應(yīng)譜，其中PAP(峰值角位置)反應(yīng)與PMI(峰值最小強度)反應(yīng)相對應(yīng)，顯示不同激動劑和細胞系的明確可區(qū)分模式。

      為了證實觀察到的細胞反應(yīng)是特異性的gpcr，細胞要么用組胺受體拮抗劑和G蛋白抑制劑處理，要么不轉(zhuǎn)染組胺受體。結(jié)果，這些細胞對300nM組胺處理沒有反應(yīng)。

      將MP-SPR PAP響應(yīng)與使用諧振波導(dǎo)光柵(另一種用于無標簽細胞測量的光學(xué)方法)測量的響應(yīng)進行比較，發(fā)現(xiàn)了相似的濃度響應(yīng)曲線。

總結(jié)

       由于其在生理過程中的核心作用，gpcr作為新藥物化合物的靶點被廣泛研究。結(jié)合全SPR曲線峰的動態(tài)角度(PAP)和強度(PMI)變化，MP-SPR用于將活細胞中活化的gpcr分離成亞型特異性信號通路，而不使用拮抗劑或其他反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。